Plásmido CRISPR de Activación (h) POL H: sc-401794-ACT

POLH codifica la ADN polimerasa eta (Pol η), una polimerasa especializada de la familia Y que realiza síntesis de ADN por translesión para sortear dímeros de pirimidina de ciclobutano inducidos por UV y otros aductos voluminosos del ADN durante la fase S. Al extender horquillas de replicación detenidas, POLH ayuda a mantener la estabilidad del genoma y se coordina con la respuesta al daño del ADN, la reparación por escisión de nucleótidos y las vías de reparación posreplicativa. Los defectos en POLH comprometen la fidelidad del bypass de lesiones y aumentan la carga mutacional, lo que vincula su disfunción con la sensibilidad a la radiación UV y fenotipos de predisposición al cáncer, incluida la variante del xeroderma pigmentoso. Por ello, POLH se estudia ampliamente en la biología del estrés replicativo, los mecanismos de mutagénesis y la comunicación entre vías que gobierna la elección de la reparación del ADN.

POL H El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

POL H El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de POL H. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de POL H en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía POL H en células tumorales con expresión de POLH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.