podoplanin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420632-ACT

Mouse Pdpn kodiert Podoplanin, ein mucinartiges transmembranes Glykoprotein, das in lymphatischen Endothelzellen, fibroblastischen retikulären Zellen und ausgewählten epithelialen Kompartimenten exprimiert wird, wo es Zellform, Adhäsion und gerichtete Motilität reguliert. Podoplanin bindet an den Thrombozytenrezeptor CLEC-2 und beeinflusst darüber das zytoskelettale Remodeling über die RhoA/ROCK-Signalkaskade; zudem koordiniert es Aktindynamiken, die für Lymphangiogenese, Gewebeorganisation und die Bildung stromaler Netzwerke wichtig sind. Im Tumormikromilieu wurden PDPN-positive Stromazellen und Tumorzellen mit invasivem Verhalten, Umbau der extrazellulären Matrix und veränderter Migration von Immunzellen in Verbindung gebracht. Eine dysregulierte PDPN-Expression ist außerdem mit entzündlichem Remodeling und fibrosisrelevanten Signalwegen assoziiert, was es zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der vaskulären und stromalen Biologie macht.

podoplanin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pdpn-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

podoplanin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pdpn-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pdpn-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen podoplanin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pdpn-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von podoplanin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des podoplanin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pdpn-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.