PLAP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400629-ACT

ALPP kodiert die plazentare alkalische Phosphatase (PLAP), ein über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankertes Ektoenzym, das extrazelluläre Substrate dephosphoryliert und zur Phosphat-Homöostase an der Zelloberfläche beiträgt. Die PLAP-Aktivität steht im Zusammenhang mit der Organisation von Membran-Mikrodomänen, der Modulation purinerger Signalwege durch Dephosphorylierung von Nukleotiden sowie der übergeordneten Kontrolle des extrazellulären Phosphomonoester-Stoffwechsels. In humanen Geweben ist ALPP vor allem in der Plazenta stark ausgeprägt und wird in der Trophoblastenbiologie sowie in keimzellbezogenen Kontexten häufig als differenzierungsassoziierter Marker verwendet. Eine fehlregulierte ALPP/PLAP-Expression wurde in mehreren krankheitsrelevanten Settings beschrieben, was ihren Nutzen für die Untersuchung von Linienprogrammen, der Funktion zelloberflächenständiger Enzyme und tumorassoziierter Expressionszustände in experimentellen Modellen unterstreicht.

PLAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALPP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PLAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALPP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALPP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PLAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALPP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PLAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PLAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALPP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.