Pitx1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402911-ACT

PITX1 kodiert den menschlichen paired-like Homeodomänen-Transkriptionsfaktor Pitx1, einen nukleären Regulator, der an DNA bindet und Genprogramme koordiniert, die Zellschicksalsfestlegung, Differenzierung und Gewebemusterbildung steuern. Pitx1 ist Teil transkriptioneller Netzwerke, die Entwicklungsprozesse prägen und durch die Modulation von Promotor- und Enhancer-Aktivität die Linienidentität aufrechterhalten. Eine veränderte PITX1-Expression oder Störungen seiner Regulation wurden in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten mit einer fehlregulierten Wachstumskontrolle und Veränderungen des Differenzierungszustands in Verbindung gebracht, was PITX1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung transkriptioneller Umprogrammierung macht. Da Pitx1 breit gefächerte Genexpressionsausgänge beeinflusst, wird es häufig in Signalwegstudien untersucht, die entwicklungsbezogene Transkriptionsfaktoren mit Programmen für Proliferation, Migration und zelluläre Identität verknüpfen.

Pitx1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PITX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pitx1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PITX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PITX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pitx1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PITX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pitx1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pitx1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PITX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.