PISD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404398-ACT

A fosfatidilserina descarboxilase (PISD) é uma enzima da membrana interna mitocondrial que converte fosfatidilserina em fosfatidiletanolamina, um fosfolipídio importante necessário para a curvatura de membrana, a dinâmica mitocondrial e a remodelação de membranas relacionada à autofagia. Ao sustentar a homeostase de fosfolipídios e a função mitocondrial ligada à fosforilação oxidativa, a PISD contribui para a bioenergética celular e a adaptação ao estresse. Alterações na disponibilidade de fosfatidiletanolamina têm sido associadas à disfunção mitocondrial, à mitofagia prejudicada e a fenótipos metabólicos e do neurodesenvolvimento mais amplos, tornando a regulação da PISD relevante para estudos de controle de qualidade de organelas. Por isso, a PISD é frequentemente investigada em vias que conectam metabolismo lipídico, tráfego de membranas e manutenção mitocondrial.

PISD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PISD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PISD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PISD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PISD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PISD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PISD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PISD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PISD em células tumorais com expressão de PISD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.