Plásmido CRISPR de Activación (m) PHD3: sc-431083-ACT

El gen Egln3 de ratón codifica la proteína 3 con dominio de hidroxilasa de prolina (PHD3), una enzima sensora de oxígeno que hidroxila las subunidades HIF-α y promueve su ubiquitinación dependiente de VHL y su degradación por el proteasoma. Mediante la regulación de los programas transcripcionales de HIF, PHD3 influye en vías sensibles a la hipoxia que controlan la angiogénesis, la adaptación metabólica, la eritropoyesis y la señalización inflamatoria. La actividad de Egln3 también se entrecruza con procesos de respuesta al estrés y apoptosis, contribuyendo a decisiones sobre el destino celular bajo limitación de nutrientes o de oxígeno. La desregulación de la señalización del eje PHD3/HIF se ha implicado en fenotipos inducidos por hipoxia relevantes para la biología tumoral, modelos de lesión isquémica y mecanismos de enfermedad inflamatoria crónica, lo que convierte a Egln3 en un nodo útil para el análisis de vías tanto in vivo como en células de ratón cultivadas.

HIF PHD3 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Egln3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HIF PHD3 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Egln3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Egln3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HIF PHD3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Egln3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HIF PHD3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HIF PHD3 en células tumorales con expresión de Egln3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.