PH-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409966-ACT

O P4HTM humano codifica a PH-4, uma prolil 4-hidroxilase associada ao retículo endoplasmático que catalisa a hidroxilação de resíduos de prolina em substratos proteicos, uma modificação pós-traducional que pode influenciar o dobramento, a estabilidade e a secreção de proteínas. Como parte da rede mais ampla de hidroxilases de prolina, a PH-4 conecta a atividade enzimática dependente de oxigênio e metabólitos à proteostase e a vias de adaptação celular. A desregulação da química de hidroxilação e do processamento no RE tem sido associada a alterações na sinalização de estresse e a fenótipos metabólicos, reforçando o interesse em P4HTM como um nó que conecta o estado redox, o controle de qualidade proteica e a regulação do estado celular. Variações genéticas e mudanças de expressão em P4HTM têm sido investigadas em contextos envolvendo características metabólicas e do neurodesenvolvimento, motivando estudos mecanísticos em modelos celulares humanos relevantes.

PH-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de P4HTM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PH-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus P4HTM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição P4HTM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PH-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus P4HTM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PH-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PH-4 em células tumorais com expressão de P4HTM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.