PGCP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-411466-ACT

O CPQ humano codifica a carboxipeptidase do glutamato plasmática (PGCP), uma metaloprotease secretada que hidrolisa resíduos de piroglutamato na extremidade N-terminal de peptídeos circulantes e extracelulares, modulando assim a estabilidade e a renovação desses peptídeos. Ao processar substratos peptídicos bioativos, a PGCP pode influenciar redes proteolíticas que se cruzam com a sinalização de nutrientes, mediadores inflamatórios e a homeostase de peptídeos extracelulares. Alterações na regulação de enzimas de processamento de peptídeos têm sido associadas a mudanças em fenótipos metabólicos e relacionados ao sistema imune, tornando o eixo CPQ/PGCP um ponto útil para estudar como a proteólise extracelular molda respostas celulares. Portanto, a expressão de CPQ e a atividade de PGCP são relevantes para pesquisas mecanísticas sobre metabolismo de peptídeos e remodelamento de vias em contextos associados a doenças.

PGCP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CPQ sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PGCP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CPQ em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CPQ, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PGCP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CPQ nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PGCP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PGCP em células tumorais com expressão de CPQ silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.