PDK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401084-ACT

Humanes PDK1 (Pyruvatdehydrogenasekinase 1) ist eine mitochondriale Kinase, die den Pyruvatdehydrogenase‑Komplex phosphoryliert und hemmt. Dadurch wird die Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl‑CoA begrenzt und der Kohlenstofffluss von der mitochondrialen Oxidation weg verlagert. Indem PDK1 Nährstoffverfügbarkeit und Sauerstoffspannung mit dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus koppelt, beeinflusst es die Glykolyse, den Eintritt in den TCA‑Zyklus und das zelluläre Redoxgleichgewicht und wird häufig mit hypoxie‑responsivem metabolischem Remodeling in Verbindung gebracht. Eine veränderte PDK1‑Aktivität wurde mit proliferativen sowie stressadaptiven Phänotypen assoziiert, wie sie im Krebsstoffwechsel und bei anderen Erkrankungen mit mitochondrialer Dysfunktion beobachtet werden.

PDK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.