patched 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404866-ACT

PTCH2 codifica patched 2, un recettore transmembrana a dodici passaggi che lega i ligandi Hedgehog e agisce come principale regolatore negativo della segnalazione di Smoothened (SMO). Modulando l’attività dei fattori di trascrizione GLI, PTCH2 contribuisce al controllo della specificazione del destino cellulare, della proliferazione e della formazione dei pattern tissutali durante lo sviluppo, mantenendo un ruolo rilevante anche nell’omeostasi epiteliale dei tessuti adulti. Una segnalazione deregolata della via Hedgehog, inclusa un’alterazione dell’espressione o della funzione di PTCH2, è stata associata a un controllo anomalo della crescita e alla biologia tumorale in diversi contesti tissutali, rendendo PTCH2 un nodo utile per studi meccanicistici sul rimodellamento della via. PTCH2 rappresenta inoltre un bersaglio agevole per indagare il crosstalk tra la segnalazione Hedgehog e altri programmi regolatori che influenzano la differenziazione e la progressione del ciclo cellulare.

patched 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTCH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

patched 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTCH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTCH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di patched 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTCH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da patched 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via patched 2 nelle cellule tumorali con espressione di PTCH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.