Plásmido CRISPR de Activación (h) p22-phox: sc-400325-ACT

CYBA codifica p22-phox, una subunidad esencial unida a membrana del complejo NADPH oxidasa de los fagocitos, que estabiliza las subunidades catalíticas NOX y favorece el ensamblaje de la maquinaria de transferencia de electrones necesaria para la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). A través de la señalización redox dependiente de NOX, p22-phox contribuye a la defensa inmunitaria innata, a la regulación de las cascadas de señalización inflamatoria y a la modulación de procesos vasculares y metabólicos. Las alteraciones en la función o la expresión de CYBA se han asociado con un estrés oxidativo desregulado y fenotipos inflamatorios, con relevancia para manifestaciones de inmunodeficiencia y para la patobiología cardiometabólica y vascular. En células humanas, CYBA se estudia con frecuencia para analizar la regulación del complejo NOX, la producción compartimentalizada de ROS y eventos de señalización posteriores, como la activación de las vías MAPK y NF-κB.

p22-phox El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CYBA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

p22-phox El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CYBA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CYBA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de p22-phox. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CYBA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de p22-phox en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía p22-phox en células tumorales con expresión de CYBA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.