Plásmido CRISPR de Activación (h) OTC: sc-402611-ACT

La ornitina transcarbamilasa (OTC) es una enzima mitocondrial que cataliza la conversión de ornitina y fosfato de carbamoilo en citrulina, un paso central del ciclo de la urea hepático responsable de la detoxificación del amoníaco. Al regular la eliminación del nitrógeno, la actividad de OTC influye en el equilibrio de nitrógeno celular, el metabolismo mitocondrial y la homeostasis de los aminoácidos, con efectos posteriores sobre el estrés oxidativo y el estado bioenergético. La desregulación de OTC se asocia con hiperamonemia y errores congénitos del metabolismo, y se ha estudiado la alteración del flujo del ciclo de la urea en contextos de reprogramación metabólica y disfunción mitocondrial. Por ello, la OTC humana sirve como un nodo útil para analizar el control del ciclo de la urea, el manejo del nitrógeno y las respuestas al estrés asociadas a la mitocondria en hepatocitos y sistemas modelo relevantes para el hígado.

OTC El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de OTC sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

OTC El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus OTC en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional OTC, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de OTC. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo OTC y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de OTC en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía OTC en células tumorales con expresión de OTC silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.