Plasmide CRISPR d'Activation (h) OPA1: sc-401555-ACT

L’OPA1 humain code une GTPase de type dynamine ancrée dans la membrane interne mitochondriale, qui contrôle la fusion des mitochondries, l’architecture des crêtes et le maintien de l’organisation des supercomplexes de la chaîne respiratoire. En coordination avec des facteurs de la dynamique mitochondriale tels que MFN1/2 et DRP1, OPA1 soutient l’efficacité de la phosphorylation oxydative, la stabilité de l’ADN mitochondrial et l’adaptation bioénergétique au stress cellulaire. La fonction d’OPA1 recoupe également la signalisation apoptotique en régulant le remodelage des crêtes et la mobilisation du cytochrome c, reliant ainsi la structure mitochondriale aux voies intrinsèques de mort cellulaire. Un dérèglement pathogène d’OPA1 est associé à une fragmentation du réseau mitochondrial et à des phénotypes neurodégénératifs, dont l’atrophie optique autosomique dominante, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la résilience neuronale et des dysfonctionnements métaboliques.

OPA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OPA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OPA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OPA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OPA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OPA1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OPA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OPA1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OPA1 dans les cellules tumorales présentant une expression de OPA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.