NUAK1/ARK5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403053-ACT

NUAK1 (auch bekannt als ARK5) kodiert eine Serin/Threonin-Kinase aus der Familie der AMPK-verwandten Kinasen, die Energie- und Stresssignale mit zellulären Überlebensprogrammen verknüpft. NUAK1/ARK5 ist an Signalnetzwerken downstream von LKB1 beteiligt und überschneidet sich mit Signalwegen, die Stoffwechsel, Zytoskelettdynamik, Adhäsion und Zellzyklusprogression steuern, einschließlich der Modulation der MYPT1/PP1-Signalgebung und der Aktomyosin-Kontraktilität. Über diese Funktionen wurde NUAK1 mit der Regulation von Proliferation, Migration und Stresstoleranz in verschiedenen Zelltypen in Verbindung gebracht. Eine fehlregulierte NUAK1-Aktivität und -Expression wurden mit der Tumorbiologie sowie weiteren Kontexten assoziiert, in denen metabolische Anpassung und invasives Verhalten untersucht werden.

NUAK1/ARK5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUAK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NUAK1/ARK5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUAK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUAK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NUAK1/ARK5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUAK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NUAK1/ARK5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NUAK1/ARK5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUAK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.