NUAK1/ARK5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403053-ACT

NUAK1 (nota anche come ARK5) codifica una chinasi serina/treonina appartenente alla famiglia delle chinasi correlate ad AMPK, che collega segnali energetici e di stress a programmi cellulari di sopravvivenza. NUAK1/ARK5 partecipa a reti di segnalazione a valle di LKB1 e interseca vie che controllano metabolismo, dinamica del citoscheletro, adesione e progressione del ciclo cellulare, inclusa la modulazione della segnalazione MYPT1/PP1 e della contrattilità actomiosinica. Attraverso queste funzioni, NUAK1 è stata implicata nella regolazione di proliferazione, migrazione e tolleranza allo stress in molteplici tipi cellulari. Un’attività e un’espressione deregolate di NUAK1 sono state associate alla biologia tumorale e ad altri contesti in cui si studiano l’adattamento metabolico e il comportamento invasivo.

NUAK1/ARK5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NUAK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NUAK1/ARK5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NUAK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NUAK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NUAK1/ARK5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NUAK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NUAK1/ARK5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NUAK1/ARK5 nelle cellule tumorali con espressione di NUAK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.