Nrl CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402610-ACT

NRL (neural retina leucine zipper) kodiert den Transkriptionsfaktor Nrl, einen basischen Leucin-Zipper-Regulator, der eine zentrale Rolle in der Photorezeptorentwicklung und bei der Festlegung der Identität von Stäbchenzellen spielt. Durch die Bindung an cis-regulatorische Elemente und die Koordination transkriptioneller Netzwerke mit anderen retinalen Faktoren steuert Nrl Programme, die an der Phototransduktion, der Ausbildung des Außensegments und der metabolischen Homöostase in differenzierten Neuronen beteiligt sind. Eine Fehlregulation der mit NRL assoziierten Genexpression wird mit erblichen Netzhauterkrankungen und eingeschränkter Photorezeptorfunktion in Verbindung gebracht, wodurch NRL ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung genregulatorischer Schaltkreise in der Retinabiologie ist. Die Aktivität von humanem Nrl ist daher relevant für Untersuchungen zur neuronalen Differenzierung, Zellschicksalsfestlegung und transkriptionellen Kontrolle in der Netzhaut.

Nrl Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NRL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nrl Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NRL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NRL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nrl-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NRL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nrl-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nrl-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NRL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.