Notch1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421930-ACT

Maus-Notch1 kodiert einen Single-Pass-Transmembranrezeptor, der die kanonische Notch-Signalübertragung vermittelt und so Zellschicksalsentscheidungen, Proliferation und Differenzierung in zahlreichen Geweben steuert. Die Ligandenbindung löst eine proteolytische Spaltung und die Translokation der Notch-intrazellulären Domäne in den Zellkern aus, wo sie mit RBPJ zusammenwirkt, um Transkriptionsprogramme zu regulieren, darunter Zielgene der Hes- und Hey-Familie. Die Notch1-Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen, die die Aufrechterhaltung von Stamm- und Vorläuferzellen, epitheliale-zu-mesenchymale Dynamiken sowie die Spezifikation von Immunzelllinien steuern. Eine fehlregulierte Notch1-Signalgebung dient weithin als mechanistisches Modell für Entwicklungsdefekte und krankheitsassoziierte Prozesse, einschließlich aberranter Differenzierung und onkogener Umprogrammierung der Transkription.

Notch1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Notch1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Notch1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Notch1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Notch1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Notch1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Notch1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Notch1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Notch1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Notch1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.