NMBR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405037-ACT

Der Neuromedin‑B‑Rezeptor (NMBR) ist ein G‑Protein‑gekoppelter Rezeptor, der das bombesinähnliche Peptid Neuromedin B bindet und dadurch die intrazelluläre Kalziummobilisierung sowie nachgeschaltete MAPK/ERK‑ und Phospholipase‑C‑Signale reguliert. Die NMBR‑Aktivität beeinflusst die neuroendokrine und gastrointestinale Physiologie, unter anderem durch Modulation der Kontraktilität glatter Muskulatur, der Sekretion und der neuronalen Erregbarkeit. Eine abnorme NMBR‑Expression und ‑Signalübertragung wurde im Zusammenhang mit Zellproliferation, Migration und rezeptorgesteuerten Transkriptionsprogrammen in unterschiedlichen Gewebetypen untersucht. Als Oberflächenrezeptor, der extrazelluläre Liganden an Second‑Messenger‑Kaskaden koppelt, stellt NMBR einen gut zugänglichen Ansatzpunkt dar, um die Dynamik der GPCR‑Signalübertragung und das Zusammenspiel von Signalwegen zu analysieren.

NMBR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NMBR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NMBR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NMBR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NMBR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NMBR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NMBR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NMBR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NMBR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NMBR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.