nicastrin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402790-ACT

NCSTN umano codifica la nicastrina, una glicoproteina transmembrana di tipo I che funge da subunità essenziale del complesso della γ-secretasi, supportando il riconoscimento dei substrati e la maturazione degli assemblaggi proteasici contenenti presenilina. Attraverso l’attività della γ-secretasi, la nicastrina contribuisce alla proteolisi intramembrana regolata di numerosi substrati, inclusi i recettori NOTCH e la proteina precursore dell’amiloide, collegando NCSTN alla segnalazione Notch, alle decisioni sul destino cellulare e al turnover delle proteine di membrana. L’alterazione dei componenti della γ-secretasi può modificare programmi di differenziamento, segnalazione infiammatoria e proteostasi, rendendo NCSTN un nodo ampiamente studiato in vie rilevanti per la neurobiologia, l’omeostasi epiteliale e la biologia della pelle. La disregolazione di NCSTN e alcune sue varianti sono state associate a disturbi che coinvolgono un’attività anomala della via Notch e risposte epidermiche o immunitarie alterate, fornendo un contesto meccanicistico per studi di genomica funzionale.

nicastrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCSTN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nicastrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCSTN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCSTN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nicastrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCSTN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nicastrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nicastrin nelle cellule tumorali con espressione di NCSTN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.