Plásmido CRISPR de Activación (h) NFS1: sc-403102-ACT

El gen humano NFS1 codifica una desulfurasa de cisteína que moviliza azufre a partir de la L-cisteína para sostener la biogénesis de los clústeres hierro–azufre (Fe–S) en las mitocondrias, actuando junto con proteínas asociadas del núcleo de la maquinaria de ensamblaje. Al permitir la maduración de enzimas dependientes de Fe–S, NFS1 influye en la fosforilación oxidativa, el metabolismo mitocondrial dependiente del ácido lipoico y la homeostasis redox, con efectos posteriores sobre la replicación y reparación del ADN y las respuestas celulares al estrés. La perturbación del ensamblaje de clústeres Fe–S puede deteriorar la función de la cadena respiratoria y la actividad de enzimas metabólicas, vinculando las vías reguladas por NFS1 con la disfunción mitocondrial y fenotipos de estabilidad genómica estudiados en diversos contextos relevantes para enfermedades. Como nodo central en la biosíntesis de cofactores mitocondriales, NFS1 se investiga con frecuencia en modelos de vulnerabilidad metabólica, estrés oxidativo y estados proliferativos alterados.

NFS1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NFS1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NFS1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NFS1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NFS1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NFS1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NFS1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NFS1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NFS1 en células tumorales con expresión de NFS1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.