Neu1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401488-ACT

NEU1 kodiert die humane Neuraminidase 1 (Neu1), eine lysosomale Sialidase, die terminale Sialinsäuren von Glykoproteinen und Glykolipiden entfernt und dadurch den lysosomalen Katabolismus sowie die Glykanzusammensetzung an der Zelloberfläche mitprägt. Neu1 wirkt innerhalb des lysosomalen Multienzymkomplexes und trägt zum Umsatz und zur intrazellulären Verteilung sialylierter Substrate bei; über die Regulation der Protein-Desialylierung beeinflusst es Rezeptorsignale und endozytotische Signalwege. Eine veränderte NEU1-Aktivität wird mit einer gestörten lysosomalen Homöostase und aberranten Glykosylierungsmustern in Verbindung gebracht, die inflammatorische Signalgebung und Prozesse der Zelladhäsion beeinträchtigen. Eine NEU1-Fehlfunktion ist mit Phänotypen lysosomaler Speicherkrankheiten assoziiert, wodurch Neu1 ein relevantes Ziel zur Untersuchung sialylierungsabhängiger Mechanismen in humanen Zellen darstellt.

Neu1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEU1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Neu1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEU1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEU1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Neu1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEU1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Neu1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Neu1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEU1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.