NEDL2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410607-ACT

O gene humano HECW2 codifica a ligase E3 de ubiquitina do tipo HECT NEDL2, um regulador da estabilidade proteica e da intensidade da sinalização por meio da degradação proteassomal mediada por ubiquitina. A NEDL2 participa do controle de qualidade celular e da modulação de vias ao direcionar substratos específicos para ubiquitinação, influenciando, assim, processos como o controle do ciclo celular, respostas ao estresse e programas transcricionais. Relações funcionais descritas situam o HECW2 na regulação, dependente de ubiquitina, de vias do desenvolvimento e neuronais, nas quais alterações de expressão ou alelos variantes têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento. Como consequência, HECW2/NEDL2 é frequentemente estudado no contexto de proteostase, crosstalk entre vias de sinalização e relações genótipo–fenótipo em modelos celulares humanos.

NEDL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HECW2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NEDL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HECW2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HECW2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NEDL2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HECW2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NEDL2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NEDL2 em células tumorais com expressão de HECW2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.