Plasmide CRISPR d'Activation (m) NEDD4: sc-421848-ACT

Nedd4 chez la souris code NEDD4, une ligase E3 ubiquitine de type HECT qui régule le renouvellement des protéines et l’amplitude des signaux en catalysant l’ubiquitination de récepteurs membranaires, de canaux ioniques et d’adaptateurs intracellulaires. Grâce à ses domaines WW, NEDD4 reconnaît des substrats contenant un motif PY et s’interface avec les voies d’endocytose et d’adressage lysosomal, modulant ainsi le trafic des récepteurs et les réseaux de signalisation en aval. L’activité de NEDD4 influence les cascades PI3K–AKT, TGF-β et d’autres voies liées aux facteurs de croissance, avec des effets étendus sur la prolifération cellulaire, la différenciation et les réponses au stress. Une dérégulation de la signalisation ubiquitine dépendante de NEDD4 a été associée, dans des modèles expérimentaux, à une homéostasie tissulaire altérée et à des phénotypes pertinents pour la biologie du cancer, la régulation immunitaire et les processus neurodéveloppementaux.

NEDD4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nedd4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NEDD4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nedd4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nedd4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NEDD4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nedd4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NEDD4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NEDD4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Nedd4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.