NAGAT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401118-ACT

ABO codifica un’attività di glicosiltransferasi A/B comunemente nota come N-acetilgalattosaminiltransferasi (NAGAT), un enzima localizzato nel Golgi che catalizza modificazioni terminali dei carboidrati sull’antigene H per generare i determinanti dei gruppi sanguigni A e B. Attraverso la regolazione della biosintesi dei glicoconiugati, ABO influenza i pattern di glicosilazione della superficie cellulare che incidono sul traffico delle proteine di membrana, sul riconoscimento cellula–cellula e sulle interazioni con lectine e mediatori immunitari. Le variazioni nelle strutture glicani dipendenti da ABO sono state associate ad alterazioni dei fenotipi emostatici e infiammatori tramite effetti su glicoproteine come il fattore di von Willebrand e altre proteine plasmatiche. Queste proprietà rendono ABO/NAGAT un modello utile per studiare meccanismi dipendenti dalla glicosilazione rilevanti per la biologia vascolare, le interazioni ospite–patogeno e la regolazione immunitaria nelle cellule umane.

NAGAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NAGAT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NAGAT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NAGAT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NAGAT nelle cellule tumorali con espressione di ABO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.