Plásmido CRISPR de Activación (h) Myosin Va: sc-402108-ACT

MYO5A codifica la proteína motora basada en actina miosina Va, una miosina procesiva que acopla la hidrólisis de ATP al transporte de largo alcance de orgánulos unidos a membrana y complejos proteicos a lo largo de filamentos de actina. En células humanas, la miosina Va favorece el tráfico vesicular, las rutas endo/exocíticas y la entrega polarizada de cargamento, contribuyendo a la organización del citoesqueleto y al control espacial de la señalización en la periferia celular. El transporte dependiente de MYO5A se entrecruza con vías reguladas por GTPasas Rab y con la fusión de membranas mediada por SNARE para posicionar gránulos secretores, receptores y ensamblajes de ARNm/proteína. La alteración o desregulación de MYO5A se ha asociado con defectos en el transporte intracelular que pueden afectar la función neuronal y la biología relacionada con la pigmentación, lo que lo hace relevante para estudios mecanísticos de fenotipos de enfermedad vinculados al tráfico intracelular.

Myosin Va El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MYO5A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Myosin Va El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MYO5A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MYO5A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Myosin Va. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MYO5A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Myosin Va en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Myosin Va en células tumorales con expresión de MYO5A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.