Plasmide CRISPR d'Activation (h) MTBP: sc-404307-ACT

La MTBP humaine (MDM2 binding protein) est un facteur nucléaire qui coordonne l’activation des origines de réplication de l’ADN et la progression de la phase S grâce à son interaction avec Treslin/TICRR et la machinerie d’activation de l’hélicase CDC45–MCM–GINS. En couplant l’initiation de la réplication au contrôle des points de contrôle (checkpoints), MTBP contribue à la stabilité du génome et influence les programmes de prolifération en situation de stress réplicatif. Des altérations de l’expression de MTBP ont été associées à une dérégulation du contrôle du cycle cellulaire et à une instabilité chromosomique, des contextes fréquemment étudiés en biologie tumorale et dans d’autres affections marquées par une fidélité réduite de la réplication de l’ADN. MTBP interagit également avec des voies qui régulent le timing de réplication, les réponses aux dommages de l’ADN et des programmes transcriptionnels qui façonnent la croissance cellulaire.

MTBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTBP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MTBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTBP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTBP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MTBP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTBP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MTBP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MTBP dans les cellules tumorales présentant une expression de MTBP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.