MRP2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400601-ACT

ABCC2 kodiert das Multidrug-Resistance-assoziierte Protein 2 (MRP2), einen ATP-bindenden Cassette-(ABC)-Effluxtransporter, der überwiegend an der apikalen Membran polarisierter Epithelzellen lokalisiert ist, etwa in Hepatozyten, Enterozyten und Zellen des proximalen Nierentubulus. MRP2 exportiert ein breites Spektrum endogener und xenobiotischer Anionen, darunter Glutathion-, Glucuronid- und Sulfatkonjugate, und unterstützt damit die Phase-II-Entgiftung sowie die Gallenbildung innerhalb hepatobiliärer Transportwege. Durch die Kontrolle des zellulären Effluxes konjugierter Metabolite trägt MRP2 zur Bewältigung von oxidativem Stress und zur chemischen Homöostase in Barrieregeweben bei. Veränderte ABCC2-Expression oder -Funktion wurde mit Phänotypen einer beeinträchtigten biliären Exkretion und mit Unterschieden in der Disposition konjugierter Verbindungen in Verbindung gebracht, wodurch ABCC2 ein relevantes Ziel für mechanistische Studien in der Leber- und Epithelbiologie darstellt.

MRP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MRP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MRP2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MRP2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MRP2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.