Mrf-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431969-ACT

Arid5a (auch bekannt als Mrf-1) kodiert ein RNA-bindendes regulatorisches Protein, das die posttranskriptionelle Kontrolle der Expression entzündungsrelevanter Gene moduliert. In Mauszellen stabilisiert Arid5a ausgewählte Zytokin- und Immunantwort-Transkripte und wirkt mRNA-Abbauwegen entgegen, wodurch es die nachgeschalteten Signalausgänge der angeborenen Immunaktivierung und von Stressantworten mitprägt. Diese regulatorische Achse überschneidet sich mit umfassenderen transkriptionellen und RNA-metabolischen Programmen, die Differenzierungszustände und die Dynamik der zellulären Aktivierung beeinflussen. Eine dysregulierte Arid5a-Aktivität wurde mit entzündlicher Pathobiologie und immunvermittelter Gewebeschädigung in Verbindung gebracht, was Arid5a zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien von Zytokinnetzwerken und entzündlicher Signalübertragung macht.

Mrf-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Arid5a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mrf-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Arid5a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Arid5a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mrf-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Arid5a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mrf-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mrf-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Arid5a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.