mPRβ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403374-ACT

PAQR8 codifica il recettore di membrana del progesterone beta (mPRβ), un recettore per i progestinici a sette domini transmembrana della famiglia PAQR che media una segnalazione rapida e non genomica del progesterone a livello della membrana plasmatica. mPRβ è stato associato alla regolazione di vie del secondo messaggero, come la modulazione del cAMP accoppiata a Gi/o e la segnalazione a valle mediata da chinasi, influenzando il controllo del ciclo cellulare, la differenziazione e programmi trascrizionali responsivi allo stress. Nei tessuti umani, l’espressione di PAQR8 è stata studiata in ambiti riproduttivi ed endocrini, in cui la segnalazione dipendente dal progesterone si intreccia con le reti degli ormoni steroidei e con il cross-talk tra recettori di membrana. La deregolazione della segnalazione del progesterone e le alterazioni dell’espressione dei recettori della famiglia PAQR vengono spesso valutate nella biologia ormono-responsiva, inclusi modelli di disturbi riproduttivi e del rimodellamento di vie associate al cancro, a supporto di PAQR8 come bersaglio per studi meccanicistici sulla dinamica della segnalazione steroidea.

mPRβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAQR8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mPRβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAQR8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAQR8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mPRβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAQR8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mPRβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mPRβ nelle cellule tumorali con espressione di PAQR8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.