MLL5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403300-ACT

KMT2E kodiert die Histon-Lysin-Methyltransferase MLL5, einen chromatinassoziierten Regulator, der Transkriptionsprogramme beeinflusst, welche die Progression des Zellzyklus, die hämatopoetische Differenzierung und die Linienfestlegung steuern. Obwohl seine katalytische Aktivität im Vergleich zu anderen Mitgliedern der KMT2-Familie diskutiert wird, ist MLL5 an der epigenetischen Regulation durch Interaktionen mit Chromatin sowie Transkriptionskomplexen beteiligt und wirkt sich dadurch auf Histonmodifikationsmuster und die Stabilität der Genexpression aus. Eine Fehlregulation von KMT2E/MLL5 wurde mit veränderten Proliferations- und Differenzierungszuständen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der myeloiden Biologie, der genomweiten Chromatinkontrolle und der krebsassoziierten Umprogrammierung von Transkriptionsnetzwerken untersucht. Diese Eigenschaften machen KMT2E zu einem nützlichen Knotenpunkt, um epigenetische Signalwege, transkriptionelle Schaltkreise und Beziehungen zwischen Phänotyp und Genexpression in menschlichen Zellen zu analysieren.

MLL5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KMT2E-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MLL5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KMT2E-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KMT2E-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MLL5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KMT2E-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MLL5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MLL5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KMT2E-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.