Plasmide CRISPR d'Activation (h) MLK4: sc-405976-ACT

MAP3K21 code la mixed lineage kinase 4 (MLK4) humaine, une kinase sérine/thréonine de la famille des MAP3K qui relie les signaux amont de stress et de facteurs de croissance à la signalisation MAPK. MLK4 a été impliquée dans la régulation des cascades des kinases JNK et p38, ainsi que dans des programmes cellulaires plus larges incluant la prolifération, la différenciation et l’apoptose, via des relais de signalisation dépendants de la phosphorylation. Des altérations de l’architecture des voies MAPK impliquant MAP3K21/MLK4 ont été associées à une dérégulation de la signalisation cellulaire observée dans de multiples contextes pathologiques, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique pour la cartographie des voies et la génomique fonctionnelle. La modulation expérimentale de MLK4 est donc pertinente pour disséquer la dynamique des réseaux de kinases, les réponses transcriptionnelles au stress et la plasticité de signalisation dépendante du contexte dans les cellules humaines.

MLK4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAP3K21 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MLK4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAP3K21 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAP3K21, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MLK4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAP3K21 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MLK4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MLK4 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAP3K21 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.