Plásmido CRISPR de Activación (m) MLH3: sc-432245-ACT

Mlh3 codifica MLH3, un factor de la familia MutL implicado en la reparación de errores de apareamiento del ADN (mismatch repair) que forma un heterodímero con MLH1 y contribuye al mantenimiento del genoma mediante la reparación de desajustes y la recombinación meiótica. En la meiosis, MLH1–MLH3 promueve la formación de entrecruzamientos (crossovers) de clase I, mientras que en células somáticas participa en la vigilancia posreplicativa que limita la acumulación de mutaciones y preserva la estabilidad cromosómica. MLH3 también interactúa con vías que responden al estrés replicativo y al daño del ADN, vinculando la capacidad de reparación con la progresión del ciclo celular. La alteración de la función de MLH3 se ha asociado con defectos en la reparación de desajustes, fenotipos de inestabilidad genómica y susceptibilidad a procesos patológicos impulsados por mutaciones, relevantes para la biología del cáncer y la investigación en genética reproductiva.

MLH3 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Mlh3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MLH3 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Mlh3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Mlh3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MLH3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Mlh3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MLH3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MLH3 en células tumorales con expresión de Mlh3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.