MK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402064-ACT

Das humane **MDK**-Gen kodiert Midkine (MK), einen sezernierten, heparinbindenden Wachstumsfaktor, der während der Entwicklung sowie bei Gewebeumbau die Zellproliferation, das Überleben, die Migration und angiogene Antworten moduliert. Die MK-Signalübertragung greift in Rezeptor-Tyrosinkinasen- und proteoglykanvermittelte Signalwege ein und beeinflusst nachgeschaltete MAPK/ERK- und PI3K/AKT-Kaskaden sowie entzündliche Transkriptionsprogramme, die die Dynamik der extrazellulären Matrix und die Zell-Zell-Kommunikation prägen. Eine Fehlregulation der MDK-Expression wurde bei verschiedensten Malignomen sowie bei pathologischen Entzündungen, Reaktionen auf ischämische Schäden und fibrotischem Umbau beschrieben, wobei sie Tumor-Stroma-Interaktionen und die Rekrutierung von Immunzellen beeinflussen kann. Als kontextabhängiger Regulator von Stress- und Reparaturbiologie wird MDK breit in Modellen der Onkogenese, Neurobiologie und Gefäßbiologie untersucht.

MK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MDK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MDK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MDK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MDK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MDK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.