MFAP4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405012-ACT

MFAP4 (microfibril-associated glycoprotein 4) kodiert ein Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das in mit elastischen Fasern assoziierten Mikrofibrillen angereichert ist und von mesenchymalen sowie vaskulären Zelltypen exprimiert wird. MFAP4 ist an der Organisation der Matrix und der Zell-Matrix-Kommunikation beteiligt und unterstützt Adhäsion und Signalübertragung über integrinverknüpfte Signalwege, die das Verhalten glatter Muskelzellen, die Aktivität von Fibroblasten und den Gewebeumbau beeinflussen. Eine fehlregulierte MFAP4-Expression und -Ablagerung wird häufig im Zusammenhang mit vaskulärem Remodeling, fibroseassoziiertem Umsatz der extrazellulären Matrix und entzündlichen stromalen Antworten untersucht. Als matrixassoziierter Faktor dient MFAP4 als nützlicher Readout und Modulator in Modellen, die die Dynamik der extrazellulären Matrix, Mechanotransduktion und mikroenvironmentabhängige Phänotypen untersuchen.

MFAP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MFAP4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MFAP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MFAP4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MFAP4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MFAP4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MFAP4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MFAP4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MFAP4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MFAP4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.