melanopsin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424378-ACT

O gene Opn4 de camundongo codifica a melanopsina, uma opsina retiniana expressa principalmente em células ganglionares da retina intrinsecamente fotossensíveis, que medeia a fotorrecepção não formadora de imagem. A sinalização da melanopsina envolve cascatas de fototransdução acopladas à proteína G que elevam o cálcio intracelular e modulam a excitabilidade da membrana, conectando a detecção de luz ao fotoarrastamento circadiano, ao reflexo pupilar à luz e à regulação do ciclo sono–vigília. Por meio de vias retina–cérebro que envolvem o núcleo supraquiasmático e outros alvos hipotalâmicos, o Opn4 influencia ritmos neuroendócrinos e comportamentos dependentes de luz. A desregulação de circuitos dependentes de melanopsina tem sido associada a perturbações na temporização circadiana, respostas pupilares alteradas e fenótipos de sensibilidade à luz relevantes para pesquisas neurocomportamentais e da retina.

melanopsin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Opn4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

melanopsin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Opn4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Opn4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de melanopsin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Opn4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de melanopsin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via melanopsin em células tumorais com expressão de Opn4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.