MATH-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404171-ACT

ATOH1 (auch als MATH-1 bekannt) kodiert einen basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor, der während der Entwicklung Zellschicksalsentscheidungen festlegt und dabei insbesondere eine wichtige Rolle in der Neurogenese sowie in der Differenzierung sensorischer Zelllinien spielt. Durch die Regulation von Transkriptionsprogrammen, die die Festlegung von Vorläuferzellen, ihre Differenzierung und Reifung steuern, ist ATOH1 in entwicklungsbiologische Signalnetzwerke eingebunden, etwa in die Notch-abhängige laterale Inhibition sowie in umfassendere, durch Chromatin vermittelte Einschränkungen der Linienwahl. Eine fehlregulierte ATOH1-Expression wurde in verschiedenen Gewebekontexten mit veränderten Differenzierungszuständen und proliferativen Phänotypen in Verbindung gebracht, was ATOH1 zu einem geeigneten Knotenpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle entwicklungsbiologischer Signalwege macht. In humanen Zellmodellen unterstützt die Modulation von ATOH1 mechanistische Forschung zu entwicklungsbezogenen genregulatorischen Netzwerken und krankheitsrelevanten Veränderungen der Zellidentität.

MATH-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATOH1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MATH-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATOH1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATOH1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MATH-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATOH1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MATH-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MATH-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATOH1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.