LYAG Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402385-ACT

O GAA humano codifica a alfa-glicosidase lisossomal, uma hidrolase necessária para o catabolismo do glicogênio no sistema endolisossomal. Ao converter glicogênio em glicose, o GAA contribui para a homeostase energética celular e previne o acúmulo de glicogênio nos lisossomos, que pode comprometer a autofagia e vias mais amplas de controle de qualidade dependentes de lisossomos. A redução da atividade de GAA está associada a uma patologia de armazenamento lisossomal caracterizada pelo acúmulo de glicogênio e efeitos secundários sobre a função de células musculares e cardíacas. Por isso, a biologia de GAA/LYAG é frequentemente estudada em modelos de função lisossomal, respostas ao estresse metabólico e processamento de glicogênio em diversos tipos celulares.

LYAG O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GAA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LYAG O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GAA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GAA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LYAG. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GAA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LYAG no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LYAG em células tumorais com expressão de GAA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.