LGR5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400726-ACT

LGR5 (leucinreiches Wiederholungsmotiv-enthaltender G‑Protein‑gekoppelter Rezeptor 5) ist ein Sieben-Transmembran-Rezeptor, der in mehreren Epithelgeweben – darunter Darmkrypten und Haarfollikel – als Marker für Stamm- und Vorläuferzellen dient. Er fungiert als hochaffiner Rezeptor für R‑Spondine und verstärkt das kanonische WNT/β‑Catenin‑Signal, indem er Frizzled/LRP‑Rezeptorkomplexe stabilisiert und so Programme der Selbsterneuerung, Proliferation und Geweberegeneration unterstützt. Durch die Modulation WNT‑getriebener transkriptioneller Netzwerke trägt LGR5 dazu bei, Differenzierungsverläufe und Nischeninteraktionen in sich entwickelnden sowie adulten Geweben zu regulieren. Eine fehlregulierte LGR5‑Expression und eine Überaktivierung des WNT‑Signalwegs sind häufig mit Tumorbiologie assoziiert und werden in humanen Modellsystemen genutzt, um krebsstammzellähnliche Zustände und Linienplastizität zu untersuchen.

LGR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LGR5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LGR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LGR5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LGR5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LGR5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LGR5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LGR5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LGR5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LGR5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.