Plasmide CRISPR d'Activation (h) L-type Ca⁺⁺ CP α1S: sc-402713-ACT

CACNA1S code la sous-unité α1S formant le pore du canal calcique de type L voltage‑dépendant du muscle squelettique (CaV1.1), un élément clé du complexe du récepteur aux dihydropyridines dans la membrane des tubules transverses. Lors de la dépolarisation membranaire, CaV1.1 s’accouple électriquement au récepteur à la ryanodine 1 afin d’initier le couplage excitation‑contraction et de réguler les flux de calcium qui déterminent la dynamique de contraction des fibres musculaires. Ce canal participe à des réseaux de signalisation dépendants du calcium qui influencent le développement musculaire, l’homéostasie métabolique et l’expression génique dépendante de l’activité. Des perturbations génétiques et fonctionnelles de CACNA1S ont été associées à des canalopathies du muscle squelettique et à une susceptibilité à une dérégulation de la gestion du calcium, ce qui souligne sa pertinence dans l’étude de la physiologie neuromusculaire et des mécanismes des maladies.

L-type Ca++ CP α1S Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CACNA1S sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

L-type Ca++ CP α1S Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CACNA1S dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CACNA1S, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de L-type Ca++ CP α1S. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CACNA1S natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de L-type Ca++ CP α1S au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie L-type Ca++ CP α1S dans les cellules tumorales présentant une expression de CACNA1S silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.