Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ksr-2: sc-402872-ACT

KSR2 humain (Ksr-2) code une protéine d’échafaudage qui coordonne la signalisation MAPK/ERK en organisant les interactions du module RAF–MEK–ERK, modulant ainsi l’amplitude et la durée du signal en aval des récepteurs aux facteurs de croissance. KSR2 intervient également dans l’homéostasie énergétique cellulaire en modulant des réseaux de signalisation kinase qui convergent vers la régulation du métabolisme, reliant les signaux mitogènes à des processus sensibles aux nutriments. Via ces interconnexions, une activité altérée de KSR2 a été associée à une dérégulation de la signalisation dans des contextes impliquant le contrôle de la croissance, la différenciation et le métabolisme systémique. Par conséquent, KSR2 est fréquemment étudié dans des modèles d’intégration des voies de signalisation pertinents pour des phénotypes liés à l’obésité, la sensibilité à l’insuline et la régulation neuroendocrinienne.

Ksr-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KSR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ksr-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KSR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KSR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ksr-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KSR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ksr-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ksr-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de KSR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.