KIR3.1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404965-ACT

KCNJ3 kodiert die menschliche inward-rectifying Kaliumkanal‑Untereinheit KIR3.1 (GIRK1), einen zentralen Bestandteil G‑Protein‑gesteuerter Kir‑(GIRK-)Kanäle, die GPCR‑Signale mit einer Hyperpolarisation der Membran koppeln. Durch die Bildung heterotetramerischer Kanäle mit anderen GIRK‑Untereinheiten trägt KIR3.1 zur Regulation der neuronalen Erregbarkeit, der Schrittmacheraktivität und der inhibitorischen Neurotransmission bei, indem es die Kaliumleitfähigkeit kontrolliert. Diese Ionenkanal‑Achse ist mit cAMP/PKA‑abhängiger Signalübertragung und nachgeschalteter Calcium‑Handhabung verknüpft und prägt so Feuermuster und synaptische Reaktionsfähigkeit. Eine veränderte KCNJ3‑Expression oder GIRK‑Kanalaktivität wurde mit elektrophysiologiebezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der Regulation neurologischer Funktionen und des Herzrhythmus sowie in zellulären Modellen von Erregbarkeit und Signaltransduktion untersucht.

KIR3.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNJ3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KIR3.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNJ3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNJ3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KIR3.1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNJ3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KIR3.1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KIR3.1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNJ3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.