Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIBRA: sc-402677-ACT

WWC1 code KIBRA, une protéine d’échafaudage enrichie dans le cerveau et le rein, qui coordonne la signalisation au niveau du cortex cellulaire et des synapses via des domaines WW et des interactions de liaison à des domaines PDZ. KIBRA participe à la régulation de la voie Hippo en modulant l’activité de LATS1/2 et les programmes transcriptionnels de YAP/TAZ, reliant la polarité cellulaire, la prolifération et la mécanotransduction au contrôle transcriptionnel. Elle interagit également avec des régulateurs du trafic intracellulaire et du cytosquelette d’actine pour influencer la dynamique membranaire et la plasticité synaptique, avec des rôles rapportés dans des voies associées à l’apprentissage et à la mémoire. Une expression ou une signalisation altérée de WWC1/KIBRA a été associée à des phénotypes neurocognitifs et à une dérégulation du contrôle de la croissance, pertinente en oncologie et dans d’autres modèles de maladies complexes.

KIBRA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WWC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIBRA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WWC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WWC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIBRA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WWC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIBRA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIBRA dans les cellules tumorales présentant une expression de WWC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.