Ki67 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400081-ACT

MKI67 codifica la proteina umana Ki67, un marcatore nucleare di proliferazione espresso durante tutte le fasi attive del ciclo cellulare e in gran parte assente nelle cellule quiescenti. Ki67 contribuisce all’organizzazione della cromatina di ordine superiore ed è necessaria per la corretta architettura dei cromosomi mitotici, supportando processi quali la progressione del ciclo cellulare, le dinamiche della cromatina associate alla replicazione del DNA e la mitosi. Come indicatore dell’indice proliferativo, Ki67 è ampiamente utilizzata negli studi dell’omeostasi tissutale e della cinetica delle popolazioni cellulari, e un’espressione alterata di MKI67 è spesso associata a una proliferazione disregolata nella biologia del cancro e in altri stati iperproliferativi. La modulazione sperimentale di MKI67 supporta lo studio di programmi trascrizionali accoppiati alla proliferazione e delle vie di controllo del ciclo cellulare.

Ki67 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MKI67 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ki67 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MKI67 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MKI67, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ki67. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MKI67 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ki67 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ki67 nelle cellule tumorali con espressione di MKI67 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.