Ketohexokinase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403399-ACT

Il gene umano **KHK** codifica la **chetoesochinasi**, una fruttochinasi arricchita in fegato e rene che catalizza la fosforilazione del fruttosio a **fruttosio-1-fosfato**, avviando il metabolismo del fruttosio e accoppiando il flusso dei carboidrati alle successive vie glicolitiche e lipogeniche. Regolando la gestione cellulare del fruttosio alimentare, KHK influenza l’utilizzo di ATP, l’omeostasi del fosfato e la ripartizione dei metaboliti verso la sintesi di trigliceridi e il turnover delle purine associato all’acido urico. Un’alterata attività di KHK è stata associata a errori congeniti del metabolismo del fruttosio e a fenotipi metabolici che includono accumulo lipidico epatico e segnali correlati alla resistenza all’insulina. In quanto nodo del metabolismo del carbonio guidato dal fruttosio, KHK è ampiamente studiato nel nutrient sensing, nella riprogrammazione metabolica degli epatociti e nelle risposte allo stress legate all’esposizione a diete ad alto contenuto di fruttosio.

Ketohexokinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KHK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ketohexokinase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KHK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KHK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ketohexokinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KHK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ketohexokinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ketohexokinase nelle cellule tumorali con espressione di KHK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.