KCC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402080-ACT

O SLC12A5 humano codifica o cotransportador K+/Cl− KCC2, específico de neurónios, um regulador-chave da homeostase intracelular de cloreto que molda a polaridade e a eficácia da neurotransmissão GABAérgica e glicinérgica. Ao acoplar a extrusão de K+ e Cl−, o KCC2 sustenta a sinalização sináptica inibitória, a maturação neuronal e a plasticidade dependente da atividade, e interage com processos do citoesqueleto e do tráfego intracelular que controlam a sua localização na membrana. Alterações na expressão ou na função do KCC2 têm sido associadas a um desequilíbrio entre excitação e inibição e a hiperexcitabilidade de redes em múltiplos contextos de doenças do neurodesenvolvimento e neurológicas. Por isso, o SLC12A5 é amplamente estudado em vias que regulam a inibição sináptica, a diferenciação neuronal e a estabilidade dos circuitos.

KCC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC12A5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KCC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC12A5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC12A5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KCC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC12A5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KCC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KCC2 em células tumorais com expressão de SLC12A5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.