karyopherin α6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403459-ACT

KPNA6 kodiert Karyopherin alpha 6, ein Adapterprotein der Importin-α-Familie, das klassische nukleäre Lokalisationssignale erkennt und Frachtproteine zur Passage durch den nukleären Porenkomplex an Importin-β koppelt. Durch die Regulierung des nukleo-zytoplasmatischen Transports von Transkriptionsfaktoren, DNA-Reparaturproteinen und Zellzyklusregulatoren trägt KPNA6 zur Kontrolle von Genexpressionsprogrammen und der Proteostase bei. Veränderte Dynamiken des nukleären Imports werden mit fehlregulierter Proliferation, Stressantworten und Genomstabilität in Verbindung gebracht und verknüpfen den KPNA6-abhängigen Transport mit Mechanismen, die in der Krebsbiologie und anderen Erkrankungen relevant sind, bei denen nukleäre Signalwege gestört sind. KPNA6 ist daher ein nützlicher Knotenpunkt, um die kompartimentabhängige Regulation von Transkription und Signalwegen zu untersuchen.

karyopherin α6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KPNA6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

karyopherin α6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KPNA6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KPNA6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen karyopherin α6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KPNA6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von karyopherin α6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des karyopherin α6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KPNA6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.