KANK4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-414866-ACT

Il gene umano **KANK4** (KN motif and ankyrin repeat domains 4) codifica un adattatore del citoscheletro che contribuisce al coordinamento tra microtubuli corticali e actina e alle interazioni cellula–matrice. Attraverso interazioni dipendenti dal motivo KN con membri della famiglia delle chinesine e il legame proteico mediato dalle ripetizioni di anchirina, KANK4 è associato alla dinamica delle adesioni focali, alla polarità cellulare e alla migrazione direzionale, processi che modellano l’architettura tissutale e la meccanotrasduzione. Le proteine della famiglia KANK sono state studiate in vie che coinvolgono la segnalazione delle Rho GTPasi, il turnover delle adesioni e il rimodellamento del citoscheletro, rendendo KANK4 rilevante per indagini sul comportamento invasivo e su fenotipi di motilità cellulare alterata. Un’espressione deregolata o alterazioni genomiche dei regolatori del citoscheletro/dell’adesione, incluso KANK4, vengono spesso esaminate nella biologia del cancro e in contesti dello sviluppo in cui i programmi di migrazione e adesione risultano perturbati.

KANK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KANK4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KANK4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KANK4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KANK4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KANK4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KANK4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KANK4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KANK4 nelle cellule tumorali con espressione di KANK4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.