ITM2B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403561-ACT

ITM2B (proteína integral de membrana 2B, também conhecida como BRI2) codifica uma proteína transmembranar do tipo II que trafega pela via secretória e sofre processamento proteolítico regulado para gerar fragmentos luminais. A ITM2B participa da homeostase de proteínas de membrana e do tráfego vesicular, e tem sido associada à modulação do processamento amiloidogênico e de vias de proteostase neuronal. No sistema nervoso, alterações na função de ITM2B estão associadas a fenótipos neurodegenerativos e à biologia da agregação proteica, incluindo demências familiares causadas por mutações em ITM2B. Essas propriedades tornam a ITM2B um alvo útil para estudar a dinâmica do endomembrana, a sinalização dependente de proteólise e mecanismos de disrupção da proteostase relevantes para a neurodegeneração.

ITM2B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITM2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ITM2B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITM2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITM2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ITM2B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITM2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ITM2B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ITM2B em células tumorais com expressão de ITM2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.