Plásmido CRISPR de Activación (h) ITI-H2: sc-402683-ACT

El gen humano ITIH2 codifica la cadena pesada 2 del inhibidor inter-alfa-tripsina (ITI-H2), una glucoproteína secretada con alta expresión en el hígado que contribuye a la estabilización de la matriz extracelular mediante la formación de complejos covalentes con el hialuronano a través de la familia del inhibidor inter-alfa. Al modular la organización del hialuronano y las redes inhibitorias de proteasas, ITI-H2 influye en la remodelación tisular, los microambientes inflamatorios y las interacciones célula–matriz relevantes para la respuesta a heridas y la biología del estroma. La alteración en la abundancia de componentes del inhibidor inter-alfa, incluido ITIH2, se ha asociado con un recambio desregulado de la matriz extracelular en la fibrosis y con la remodelación de la matriz asociada a tumores en la biología del cáncer. Estas propiedades hacen de ITIH2 una diana útil para estudiar el ensamblaje de la matriz dependiente de hialuronano y los cambios en la proteostasis extracelular vinculados a la inflamación.

ITI-H2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ITIH2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ITI-H2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ITIH2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ITIH2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ITI-H2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ITIH2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ITI-H2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ITI-H2 en células tumorales con expresión de ITIH2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.