Plasmide CRISPR d'Activation (h2) ITF: sc-416266-ACT-2

Le gène humain TFF3 (trefoil factor 3) code le peptide sécrété ITF, un facteur « trefoil » associé aux mucines et fortement exprimé dans l’épithélium intestinal et d’autres épithéliums muqueux, où il soutient l’intégrité de la barrière en favorisant la restitution épithéliale, la migration et les réponses de réparation au voisinage des lésions. TFF3/ITF interagit avec des composants du mucus et module des voies de signalisation liées au remodelage du cytosquelette et à des programmes de survie, notamment des processus associés à MAPK/ERK et PI3K/AKT, influençant ainsi le maintien des jonctions intercellulaires et l’adaptation au stress inflammatoire. Une expression dérégulée de TFF3 a été rapportée dans des contextes de lésion muqueuse et d’inflammation chronique, et le gène est fréquemment étudié dans les troubles gastro-intestinaux ainsi que dans les cancers épithéliaux, où elle peut être corrélée à des phénotypes de différenciation, d’invasion et de métastase altérés. L’édition génétique de TFF3 permet une dissection mécanistique des voies de réparation muqueuse, du dialogue épithélio-immunitaire et de la contribution des facteurs sécrétés dans des modèles d’organoïdes, de barrière et de microenvironnement tumoral.

ITF Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TFF3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ITF Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TFF3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TFF3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ITF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TFF3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ITF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ITF dans les cellules tumorales présentant une expression de TFF3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.