Islet-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421157-ACT

Mouse Isl1 kodiert Islet-1, einen LIM-Homeodomänen-Transkriptionsfaktor, der während der Embryogenese die Festlegung von Zellschicksalen sowie Differenzierungsprogramme steuert. Islet-1 reguliert Gennetzwerke, die an der endokrinen Pankreasentwicklung, der Bildung von Motoneuronen und der Biologie kardialer Vorläuferzellen beteiligt sind, und integriert sich in entwicklungsbiologische Signalwege, um Linienfestlegung und Reifung zu kontrollieren. Eine fehlregulierte ISL1-Aktivität wurde in Modellsystemen mit einer veränderten β‑Zell-Identität und -Funktion, neuroentwicklungsbedingten Defekten motorischer Schaltkreise sowie angeborenen Herzphänotypen in Verbindung gebracht, wodurch ISL1 ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle der Organogenese ist. Als Linien- und Vorläufermarker wird Islet-1 häufig genutzt, um Entwicklungstrajektorien zu kartieren und regulatorische Elemente zu untersuchen, die gewebespezifische Genexpression prägen.

Islet-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Isl1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Islet-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Isl1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Isl1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Islet-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Isl1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Islet-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Islet-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Isl1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.